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BeYaMATM 1干细胞无血清培养基实验操作手册
华雅思创生物 / 2015-12-08

BeYaMATM 1干细胞无血清培养基实验操作手册:

一、   培养皿包被

1、      4℃溶解MatrigelBD 354277)过夜,轻摇混匀。请注意:原液应是均质粘稠的半流体状态,要避免温度过高,否则Matrigel会变成凝胶状态。

2、      冰上预冷1.5ml离心管和移液器枪头,冰上快速将Matrigel分装成350-500ul/支,储存于-80℃,用前置于4℃解冻。

3、      将溶解的Matrigel加入25ml预冷的无血清DMEM/F12培养基中,轻轻混匀,避免产生气泡。

4、      将稀释的Matrigel加入六孔板中,1ml/孔,轻摇培养板,使Matrigel均匀铺在培养板底部。

5、      Parafilm封好包被的培养板,置于4℃储存,用前置于37℃培养箱中孵育至少1小时。

二、   培养液准备

1、      4℃解冻BeYaMATM 15X Supplement(货号:HJ0103M)添加剂,加入BeYaMATM 1Basal Medium(货号:HJ0102M)基础培养基中,形成500mL BeYaMATM 1 Complete Medium(货号:HJ0101M)完全培养基。

2、      BeYaMATM 1完全培养基可在4℃稳定储存2周。可按实际用量将BeYaMATM 1完全培养基分装后置于-80-20℃保存,避免反复冻融。

三、   hESCs/hiPSCs复苏

1、      复苏hESCs/hiPSCs前,复温Matrigel包被的培养板,吸弃孔内液体,加入2ml BeYaMATM 1完全培养液及2ul 5uM/L Rock Inhibitor Y27632,用以促进细胞贴壁。

2、      从液氮罐中取出hESCs/hiPSCs冻存管,浸入37℃水浴,轻轻摇晃,直到细胞融化至仅剩一小块冰晶,迅速取出并用75%酒精擦拭冻存管外表面,转移至无菌超净台中。

3、      将细胞悬液接种至准备好的培养板中,轻轻晃动使细胞均匀分布在板底。

4、      小心将培养板放置于培养箱中,避免振动。

5、      30-90min后显微镜下观察细胞基本贴壁,更换新鲜BeYaMATM 1完全培养液,之后每24h换液,4-6天后传代。

四、   hESCs/hiPSCs传代

1、    提前准备好MatrigelBD 354277)包被过的六孔板,吸弃孔内包被液,加入2ml BeYaMATM 1完全培养液。

2、    吸弃待传代hESCs/hiPSCs孔内的培养液,并用1ml无钙镁的PBS1遍。

3、    加入0.5ml Accutase细胞分离液使之完全覆盖皿底。

4、    室温孵育5-8分钟或37℃孵育3-5分钟,显微镜下观察到大部分克隆细胞间出现间隙,细胞表面发亮但尚未相互分离时,可吸去Accutase

5、    可将培养板放置37℃继续孵育1min,或者直接加入适量新鲜BeYaMATM 1完全培养液,轻轻摇晃,干细胞集落基本脱落。亦可用细胞刮刀将剩余克隆轻轻刮下,尽量避免用枪头反复吹打细胞。

6、    将制备好的细胞悬液按13 - 16的比例接种至准备好的培养板中,注意细胞过密则克隆边界不圆滑,易分化,细胞过稀则克隆存活率降低。

7、    轻轻摇晃培养板让细胞均匀分散,置于37℃,5% CO2培养箱中培养过夜。

8、    每天更换培养液,待细胞密度达到80%以上,或者克隆中央密度过大,影响细胞生长时进行传代。

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