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CIK细胞的制备方法--华雅思创生物
华雅思创生物 / 2016-06-24

【背景】
       CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写,中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群,其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性,又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广,对正常组织毒性低,体外可高度扩增等特点,是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。

【推荐试剂】上海华雅思创生物科技有限公司现货供应:021-64933729      

生产商 产品名称 产品编号 产品规格 使用浓度
PeproTech 重组人IFN-g(Animal Free) AF-300-02 100ug/250ug/500ug/1mg 50ng/ml
PeproTech 重组人IL1-a(Animal Free) AF-200-01A 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重组人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50ug/100ug/250ug/500ug/1mg 30ng/ml
      注:Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质,尤其是
      牛蛋白的混入,使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病,克雅氏病
      等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应,因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成
      分的重组细胞因子。
 

       【其它相关试剂】

生产商 产品名称 产品编号 产品规格
PeproTech 重组人Flt-3 Ligand(Animal Free) AF-300-19 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重组人IL-7 (Animal Free) AF-200-07 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重组人IL-15 (Animal Free) AF-200-15 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重组人SCF (Animal Free) AF-300-07 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg

【培养原理】
    CIK培养用细胞因子和抗体:

  • CD3激发型单抗:

         T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体,即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的
 抗原的特异性结合,也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体,在T细胞表面,其与
 CD3分子通过非共价键结合,形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4
 或CD8分子的胞浆尾部聚集,进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等),促使CD3分子胞浆的
 免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的
 酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白,从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等),
 最终通过激活转录因子,使其进入细胞核内,结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等),引起基因的
 表达和转录,T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。 

        由上可见,CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特
  异性结合后,可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化,进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活,
  从而使T细胞增殖和活化。也就是说,CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程,从而引
   起T细胞的增殖与活化,因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
 
        此外,CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明,仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激
  所有人的T细胞的增殖,而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此,在进行CIK培养时,最
  好选用OKT-3克隆,以保证每个患者的T细胞均能被激活。

  • IL-2 (白细胞介素-2)

         IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF),是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2
  既是自分泌细胞因子,也是旁分泌细胞因子,其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活
  化,并进入细胞分裂状态。此外,IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2,
  以促进T细胞的增殖与活化。

  • IFN-g(干扰素-g)

         IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用,因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在
 诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ,可降低IL-2的用量。研究发现,IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相
 关。先加入IFN-g,培养24后再加入IL-2,可明显提高CIK的细胞毒活性。

  •  IL-1-a (白细胞介素-1a)  

         IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时,可以明显提
 高CIK 的细胞毒作用。
 
【细胞制备】
1.  外周血单个核细胞的采集
   
 1.1    用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL;
     1.2    淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC);
     1.3    无血清培养液洗涤2次,获得纯度在90%以上的PBMC。
 2.  CIK细胞的培养及鉴定
     2.1    将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中,加入1000 U/ml 的重组人IFN-g,37oC,5%CO2
               养箱中培养;
     2.2    24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2,刺激CIK 细胞的生长和增殖。
               注:此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a
     2.3     每3天半量换液或扩瓶一次,并补加重组人IL-2 300 U/ml;
     2.4     在培养的第14d,收获CIK细胞。
     2.5     CIK细胞质控:
           2.5.1     台盼蓝染色检测:活细胞应在80%以上;
           2.5.2     流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达:CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
           2.5.3     细胞杀伤实验:以CIK细胞为效应细胞,以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞,将效
                         应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中,每孔含靶细胞1 x 104个,终体积为200
                         ml,设3个复孔。培养4h,然后取培养上清,用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀
                         伤率。
            2.5.4    收获细胞前,取少量培养物进行细菌、真菌培养,并检测支原体、衣原体,及内毒素(标准:病原学检
                         测阴性,内毒素<5 Eu)。 


【步骤简图】

 
【参考文献】
         [1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II
              clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133